熒光蛋白的介紹和光譜特性

隨著20 世紀 50 年代熒光蛋白的發現，熒光顯微鏡技術的發展前景發生了巨大的變化，而這一切均源于OsamoShimomura，他首次在維多利亞多管發光水母中發現了綠色熒光蛋白 (GFP)。后來，研究人員又發現了數百種 GFP 突變體，熒光蛋白也涵蓋了從藍色到紅色光譜的廣泛范圍。隨后，研究人員在珊瑚蟲綱等其他物種中發現了更多熒光蛋白，甚至將發射波長延伸到了遠紅外區域。這就為科學家們尋找符合自身要求的理想熒光蛋白標簽提供了廣泛的可能性。本文概述了熒光蛋白領域的*新變化，還提供了一張排列清晰的表格，囊括了所有相關熒光蛋白的光譜特性。

維多利亞多管發光水母(A.victoria)中的熒光蛋白

GFP 或其變體的光譜特性在于構成發色團（圖 1）的氨基酸結構。它們通常是在第 65–67 位上的三個氨基酸，或著是靠近該位置的氨基酸殘基（例如，YFP）。除了關于發色團的主要突變以外，科學家還對其他基因位點定點誘變，以改善它們在異源性細胞系中的一些性能，包括蛋白的成熟和表達等其他因素（在生理溫度下對密碼子的選擇以及蛋白質折疊等）。有一點需要注意的是，維多利亞多管發光水母是相對原始的海洋生物，它是沒有體熱系統的。

圖 1：GFP的分子結構

即使因亮度和高光穩定性而成為*普遍熒光蛋白之一的 GFP，亦存在兩大缺點：對 pH 具有一定的敏感性，以及存在二聚化的輕微傾向性。二聚作用或寡聚化是很多熒光蛋白都會發生的問題之一。這些熒光蛋白偏向于彼此積聚，這種積聚現象會導致出現偽影或對融合蛋白的位置和功能發生誤釋的情況。但科學家們也針對上述問題提供了解決方案。通過氨基酸關鍵位置的突變（F223R、L221K和 A206K），即親水氨基酸替代非極性氨基酸，可以減少二聚化現象。所有可以使光譜得到改善以及具有實用性的遺傳變化均以“增強型” FP 予以命名。

例如，wtGFP 經過增強變成了 EGFP（增強型 GFP），在波長為 488 nm處有單個激發峰，替代了原先在395 nm 和 475 nm處的復合吸收光譜。RogerTsien 等人發現的 wtGFP 首個突變型（S65T 突變型）比原始 wtGFP 要亮五倍，蛋白成熟時間也更短。而另一突變體 (F64L)，其在 37°C下的蛋白成熟效率更高，這在人們觀察活細胞中發揮了重要作用。

Sapphire 是一個受到廣泛關注的 GFP 突變體，它表現出*大的斯托克斯位移(Stokes shift)。接近發色團位置上的突變區域(T203I)使其激發峰和發射峰分別變成了 399 nm 和 511 nm。Sapphire 表現出 112 nm 的斯托克斯位移。Emerald 是另一種 GFP 修飾，其光穩定性和亮度都經過了改善，且它在哺乳類細胞中可以更高效地進行蛋白折疊。

所有綠色熒光蛋白的亮度均相對較高，與此相反，在微觀應用領域中，藍色熒光蛋白的發射光強通常會降低。盡管如此，它們還是因為其他光譜屬性而應用于光學檢測領域。EBFP（增強型藍色熒光蛋白）是經過幾輪 wtGFP 突變而形成的。第一個突變體(Y66H)發射峰跳過綠色直接到藍色光譜，而隨后的突變體則產生*大激發和發射波長分別為 380 nm 和 448 nm 。這些光譜屬性令其成為EGFP 在 FRET 顯微鏡中的“搭檔”。*新發現的藍色熒光蛋白包括Azurite、SBFP2 以及 EBFP2，這些熒光蛋白具有更高和更好的量子產率和光穩定性。目前，Sirius 是一款接替 EBFP 且擁有廣闊前景的熒光蛋白，這種蛋白因其對 pH 的高耐受力（pH 3 -9 范圍內均能保持穩定）而被廣泛應用，此外，它還是**為止人們所發現的發射波長*短的熒光蛋白。

第二個“藍色”系列的GFP突 變體是由藍綠色熒光蛋白構成的—CFP。用色氨酸代替酪氨酸 (Y66W) 和進一步遺傳變異，使熒光染料的亮度和光穩定性得以改善。這種ECFP 具有激發和發射雙峰光譜，分別位于 433/445 nm 和 475/503 nm處，其亮度僅為 EGFP 的 40% 左右。Cerulean是**的ECFP突變體，其具有較高的消光系數和量子產率，在亮度方面，它比 ECFP 高出 1.5 倍，并與 YFP 一起被用于FRET 之中。

GFP 突變體并不能直接改變發色團中三種主要氨基酸中的其中一種，因而導致黃色熒光蛋白增多。YFP 主要是由于蛋白 203 位的常見蘇氨酸變為酪氨酸 (T203Y)。該氨基酸是 β桶的一部分，靠近發色團。相比 GFP，YFP激發和發射波長均變大，*大激發和發射波長分別為 514 nm 和 527 nm (EYFP)。EYFP 的其中一個特性就是它較高的 pH 敏感度。pH 為 6.5 時，EYFP 僅產生 50% 熒光，該特性并不總是缺點。對水皰、核內體等進行 pH 值檢測時，EYFP 可以作為一項檢測指標。有趣的是，該熒光的進一步突變 (Q69M) 會獲得更好的耐酸性，并極大的提高了亮度（其亮度比 EGFP 高出 75%）。Citrine是一種光穩定性比 EGFP 要差的蛋白。另外一種 YFP 突變體 (F46L) 的蛋白成熟速度顯著提高，且耐酸堿性得以改善，這種蛋白被稱為Venus，是一種天藍色 FRET 受體。

珊瑚蟲熒光蛋白

正如我們在第一部分所了解的，維多利亞多管發光水母中的大多數熒光蛋白發射光的范圍為藍色至黃色光譜，但紅色熒光蛋白缺失。俄羅斯科學家 Sergey A. Lukyanov 在珊瑚蟲類中發現熒光蛋白后，彌補了上述缺陷。由于紅色光譜中的細胞自發熒光少很多，因此，相比其他熒光蛋白而言，紅色熒光蛋白有著較大優勢。此外，這些紅色熒光蛋白受到波長較長的光的激發，這對于活細胞是有利的，相比之下，波長較短的光會對樣本造成損傷。相比水母蛋白，珊瑚類動物蛋白還有一項普遍存在的優勢：在37°C 溫度條件下，能夠實現高效成熟。但維多利亞多管發光水母 GFP 及其衍生物必須經過基因修飾，并且需要以正確的方式進行蛋白質折疊才可得到成熟的蛋白，而珊瑚蟲類蛋白無需分子設計即可成熟。這可能得益于它們群落生境中較為溫暖的水溫環境?！?/span>

DsRed 是人們在珊瑚蟲中發現的首個熒光蛋白，而且它也是目前*常用的熒光蛋白之一。這種熒光蛋白的名稱來源于?？?Discosoma striata)。DsRed 的*大激發和發射波長分別為558 nm 和 583 nm。但當這種熒光蛋白的結構信息發布以后，首次發現所帶來的欣喜卻無法繼續維持了。因為人們發現 DsRed 蛋白的成熟速度要比水母熒光蛋白緩慢很多，而且中間還需經歷發色團載物臺。在該載物臺，DsRed發射綠光，與其他熒光蛋白發生重疊。正如 GFP 部分所描述的，DsRed 還存在一個問題：紅色熒光?？鞍资菍Ｐ运木垠w，并易于形成寡聚體，這會導致融合蛋白的位置和功能發生誤釋。一般來說，珊瑚蟲熒光蛋白與多管水母熒光蛋白的結構相似，發色團隱藏在β桶結構內，大小為 4 nm x 3 nm（高 x 直徑）。而珊瑚蟲類 β桶更顯橢圓狀，這就是二者的差異所在（圖 2）。

圖 2：DsRed 的分子結構

GFP “進化”的同時，研究人員開始修飾原始 DsRed，以克服它的結構缺陷。第二代DsRed，即DsRed2，經過突變改造后，熒光蛋白的寡聚物形成趨勢減弱，蛋白成熟速度加快，并*大程度的減少了發射綠光的中間載物臺。之后進一步誘變將產生紅色熒光蛋白，而這種熒光蛋白完全拋棄了四聚體狀態，但會以犧牲部分量子產率（DsRed2的 25%）為代價。Tsien 等人首次研究出了單體紅色熒光蛋白，這種熒光蛋白被稱為 mRFP1。

mRFP1 隨即成為構造六種單體熒光蛋白的起點，其被稱為 "mFruit"。這些熒光蛋白的名稱都是按照它們發射光線的顏色來命名的：mHoneydew、mBanana、mOrange、mTangerine、mStrawberry和 mCherry。mCherry是這些熒光蛋白中*為實用的，發射光在 610 nm 范圍內，亮度為 EGFP 的50%。

到目前為止，*亮的熒光蛋白是 mFruit 系列的后續產物，其被稱為 tdTomato。經過基因改造后，dTomato 成為一種專性二聚體，但將兩個二聚體放進同一個分子后，就能夠避免產生二聚作用。兩個 dTomato 單位是通過12 個氨基酸組成的短鏈相連接，構成串聯二聚體熒光蛋白tdTomato，這種熒光蛋白的*大發射波長為 581 nm，并在*高區域擁有良好的光穩定性。

當另一種 mFruit 后續蛋白產生后，發射光譜將進一步移至遠紅外區域 (630 nm –700 nm)。mPlum 屬于 mFruit 系列的一種，它比任何mFruit 蛋白的發射波長都要深遠，在紅外區的649 nm處。

能夠為科研所利用的綠色熒光珊瑚蟲蛋白的數量是非常少的，但鑒于眾所周知且被廣泛使用的維多利亞多管發光水母GFP ，這一點就不足為奇了。顯然，人們并未發現構建新型綠色熒光蛋白的必要性。雖然如此，也還是有一些的，比如，來自石珊瑚 Galaxeidae的明亮熒光蛋白，被稱為 Azami Green。有趣的是，它與EGFP 的同源序列低于 6%。

此外，還有一種珊瑚蟲蛋白會對深層組織成像產生重大影響，即Katushka。它是通過奶嘴?？鸕FP 的進一步突變，產生了一種二聚體蛋白，人們將其命名為 Katushka，其*大發射波長為 635 nm，并且是所有深紅色熒光蛋白區亮度*強的熒光蛋白。Katushka的單體形式為mKate，它提供的亮度更強，因而產生了mKate2。

綜上所述，如今用于顯微鏡應用領域的所有熒光蛋白都是從原始的海洋生物衍生而來的。表 1 涵蓋了一些*重要的熒光蛋白及其相關的光譜特性，例如，*大激發和發射波長、光穩定性、量子產率和亮度。

前景展望

一個相當有趣的發現是：有一種FP 是通過脊椎動物予以表達的。文昌魚是一種類似魚的海洋脊索動物，它身體的側前壁會產生AmphiGFP。對這個熒光蛋白的序列分析可以預測到典型的β-桶狀結構，且似乎與橈足動物Pontellina plumata（甲殼綱動物）的CopGFP具有相關性。這項發現表明了熒光現象并不受限于原始的無脊椎動物，在一些高等動物中也會存在熒光現象。此外，這項發現還顯示了熒光蛋白發現、處理和完善的持續過程，如今這仍是研究人員探討的熱點課題。這一事實證實了熒光蛋白在*近和將來生命科學研究中的重要意義和深遠影響。

熒光蛋白的光譜特性

表 1：熒光蛋白，資料來源：http://flowcyt.salk.edu/fluo.html

Ex：激發光波長(nm)
Em：發射光波長 (nm)
MW：分子量
QY：量子產率
BR：亮度；消光系數 * 量子產率/1,000
PS：光穩定性；亮度達到 50% 所需的時間（秒）